الطالبة :منى الصباغ/هيئة البحوث العلمية الزراعية – قسم التقانات الحيوية
جامعة حلب – كلية الزراعة
2008

الملخص

هدفت هذه الدراسة إلى وضع تقنية شاملة ومفصلة للإكثار الخضري الدقيق بدءاً من زراعة القمم النامية لصنف الكرزPrunus serrula   المدخل من الولايات المتحدة الأمريكية وثلاثة أصول من اللوزيات هي:GF. 8.1  P. marriana  المدخل من فرنسا وأصل الكرز البري Prunus avium L. وأصل الدراق P. Japonica   والمدخل بشكل زراعات نسيجية من اليابان بهدف إنتاج نباتات قوية النمو وخالية من الأمراض الفيروسية.
كما درست إمكانية التجديد من نسيج الأوراق لأصول الكرز المكاثرة مخبرياً Mahaleb , Maxma-14 , Weiroot-10 ومن ثم تجذيرها وإكثارها وزراعتها في الحقل، إضافة  لتطبيق تقنية التطعيم الدقيق للأصول Mahaleb , Maxma-14 , Weiroot-10 بالصنفP. serrulata  بغية إنتاج غراس لوزيات مطعمة وخالية من المسببات المرضية وخاصة الفيروسية منها، ومتجانسة في تركيباتها الوراثية، مع ضمان نوعية وجودة الغرسة المنتجة.

تم بنتيجة هذه الدراسة تطوير طريقة متكاملة وناجحة للإكثار المخبري الدقيق لأصول اللوزيات:Prunus avium L. و GF.8.1  cv. Prunus mariana و P. japonica. وصنف الكرز Prunus serrula من خلال زراعة القمم النامية والبراعم الخضرية ودون المرور بمرحلة تشكل الكالوس.
وأمكن استعادة القدرة على نمو وإكثار الأصلGF-8-1  cv. Prunus mariana بعد الحفظ الطويل الأمد بالتجميد العميق في الازوت السائل بدرجة حرارة -196مº حيث حافظت على حيوية الميرستيم وعلى استمرار قدرته على النمو والتكاثر.
تم مراقبة سلوك وأداء ونمو بعض النباتات المزروعة في البيت الزجاجي ثم نقلت للزراعة في الحقل تحت الشروط الطبيعية حيث بلغ طولها في نهاية فصل النمو 1 م، كما اجتازت فصل الشتاء بشكل جيد وابتدأ نموها في بداية الربيع التالي بشكل طبيعي ومتجانس. وعموماً فإن النباتات الناتجة من زراعة الأنسجة كانت سليمة وقوية النمو وخالية من أية انحرافات ظاهرية. والغراس حالياً بعمر أربع سنوات ومشابهة مورفولوجياً للنبات الأم، وتم تطعيمها بأصناف عديدة مـن اللوزيات من أجل دراسـة سلوكها وأدائهـا الحقلي.
وأوضحت نتائج تجارب التخزين البارد أن النموات المستأصلة من الزراعات المحفوظة بظروف التبريد لم تتأثر أو تتضرر بالتخزين الطويل الأمد حتى فترة 8-12 شهراً. مما يتيح إطالة الفترة اللازمة لإعادة الزراعة لتتم مرة كل 8-12 شهراً بدلاً من كل أربعة أسابيع. ولتكون بنكاً وراثياً لحفظ هذه المصادر الوراثية القيمة في الأنابيب ضمن حجم محدود مما يمكن من إكثارها مجدداً كلما دعت الحاجة.

وتـم وضع تقنية كاملـة ومفصلة وناجحـة للتطعيم المخبري الدقيق لصنف الكرز P. Serrula على أصلين للكرز هما Maxma Delbard 14 و Weiroot حيث طعمت قمم نموات صغيرة بطول 0.1-1 ملم من الصنف P. Serrula على الأصلين المذكورين مخبرياً وتحت شروط معقمة حسب الخطوات التالية: تحضير الأصول، تحضير الطعوم، إجراء التطعيم، تنمية النباتات المطعمة مخبرياً ، النقل للتربة. ودرست بعض العوامل المؤثرة على نجاح التطعيم.
وقد أثبتت الاختبارات المصلية التي أجريت في ألمانيا باتباع طريقة ELISA خلو نباتات الأصل والطعم من الفيروسات  PPV، PNRsV، Apple mosaic virus، ACLSV، ToRSVو PDV.
نقلت المطاعيم الناجحة بعد 3- 6 أسابيع من عملية التطعيم حيث ظهر عليها ورقتين على الأقل إلى أصص تحوي خليط من البيتموس :البيرليت بنسبة 1:3   (حجم/حجم) ووضعت في غرفة على درجة حرارة 18±1ْس وإضاءة  تعطي تدفق فوتوني بمقدار 54 µmol m-2 s-1 لمدة أسبوعٍ، ثـم على درجة حرارة 22±1ْس لمـدة 2 أسبوع. حيث غطيت النبتات بأكياس شـفافة من مادة البولي ايتيلين للمحافظة على الرطوبة العالية ثـم خفضت الرطوبة تدريجياً بعمل ثقوبٍ صغيرةٍ ثم أكبر فأكبر حتى إزالـة الأكياس نهائياً بعد 4 أسابيع، وقد اسـتغرقت عمليـة التقسية فترة تراوحت بين 3-4 أسابيع.
زرعـت النمـوات المخبرية لكـل مـن الأصولMaxma-14, Weiroot  والصنف P. Serrulla والمكاثرة مخبرياً في أنابيب تحوي 25 مل من وسط MS وبظروف غرفة العزل الجرثومي من أجل التجذير والاستطالة معاً، حضنت النموات فـي غرفة النمو على درجة حرارة 24±1 سº وفترة إضاءة 16 ساعة و8 ساعة ظلام وشدة إضاءة 2000-5000 لوكس.

تم بنتيجة دراسة التجديد من نسيج الأوراق الحصول على نموات خضرية من أصول الكرز المكاثرة مخبرياً وهي: Mahaleb , Maxma-14 , Weiroot-10 ومن ثم إكثارها وتجذيرها وتقسيتها وتعتبر هذه التقنية شرطاً أساسياُ لإجراء التحوير الوراثي لاحقاً، وكذلك بغية دراسة التغيرات الوراثية في النباتات الناتجة لاختبار الأفضل منها مستقبلاً لأهداف التربية، ومن ثم تجذيرها وإكثارها وزراعتها في الحقل .
وتم بنجاح عزل واستنساخ مورثة الغلاف البروتيني لفيروس تقزم الخوخ في اللوزيات ونفذت هذه الدراسة بجامعة هانوفر قسم وقاية النبات، ويعتبر هذا النجاح خطوة أولية هامة للحصول فيما بعد على نباتات كرز مهندسة وراثياً ومقاومة للفيروس. لقد أمكن عزل RNA وهو المادة الوراثية للفيروس المذكور ومن ثم الحصول على DNA  بإجراء عمليةPCR  RT- للمادة الوراثية، ثم حددت القطعة المسؤولة عن إحداث المقاومة باستخدام برايمرات متخصصة (وهي قطع صغيرة من DNA حوالي 20 bp) ثم أجريت عملية استنساخ (Cloning) للقطعة المرغوبة من المادة الوراثية للفيروس بعزلها ومن ثم إدخالها في ناقل (بلاسميد) والذي نقل إلى خلية  E. Coli  باجراء عمليةTransformation  والتي تعتمد على الصدمة الحرارية وبهذا تم الحصول على عدد كبير من النسخ لقطعة DNA المرغوبة، علماً أن عملية الاستنساخ تمت على عدة مراحل وباستخدام عدة نواقل (بلاسميدات) مع مراعاة إجراء عملية القص واللصق بنفس أنزيمات القطع لكل من القطعة المرغوبة والبلاسميد المختار، بعدها تم إنتخاب خلاياE. Coli  التي تحمل البلاسميد المرغوب.
وبما أن بكتريا E. Coli  غير مناسبة لإحداث العدوى بالنباتات فقد أجريت عملية Transformation منها إلى بكتريا التدرن التاجي Agrobactirum بواسطة الثقب الكهربائي مع انتخاب البكتريا الحاملة للبلاسميدات المرغوبة التي تصبح جاهزة لإحداث العدوى  بنباتات الكرز المكاثرة مخبرياً للحصول على نباتات تحمل مورث مقاومة فيروس تقزم الخوخ.