الطالبة :نبيلة محمد علي باشا الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية– قسم التفانات الحيوية
جامعة حلب- كلية الزراعة
2009

الملخص

هدفت الدراسة الحالية إلى تطوير طريقة مناسبة لتشكيل النموات الخضرية بشكل مباشر من الأوراق ثم التحوير الوراثي لصنف التفاح ‘Golden Delicious‘ والأصل ‘MM111’ بالمورثة g2ps1 من أجل زيادة مقاومتها للأمراض الفطرية. تشفر المورثة g2ps1  من نبات الجربيرا التزيني لأنزيم البيرون الذي يضفي المقاومة للأمراض الفطرية.
تم الحصول على النموات العرضية لصنف وأصل التفاح المدروسين من أجزاء الورقة من نباتات مكاثرة مخبرياً. تم الحصول على نسبة تجديد بلغت 90%, 92% من المستزرعات التي أعطت نمواً واحداً أو أكثر مع معدل تجدد بلغ 4 و 4.1 لصنف التفاح ‘Golden Delicious‘ والأصل ‘MM111′ على التوالي وذلك في الشروط المثالية على الوسط الأساس المحتوي على:
0.2 mg/l NAA +MS + B5 vitamins +1g/l MES +  2 mg/l TDZ
لم يحدث تشكل النموات العرضية على الأوساط بدون سيتوكينينات. اعتمدت قدرة تشكل الأعضاء لأجزاء الورقة على عمر الورقة ومصدر الجزء النباتي (جزء الورقة) حيث كانت الأوراق الفتية الخضراء فاتحة اللون أكثر قدرة على التجدد من الأوراق الأكبر عمراً. كما كان الجزء المتوسط من الورقة أكثر استجابة للتجدد من الجزء القمي أو القاعدي للورقة.
حدث تشكل النموات العرضية على كل من مكان قطع الورقة وعلى سطوح مستزرعات الأوراق المخدوشة بالملقط غير المحدث للرضوض non- traumatic .
شملت خطوات التحوير الوراثي ما يلي:
–    تأسيس الزراعات المخبرية لصنف التفاح’Golden Delicious‘  والأصل ‘MM111’
–    تطوير طريقة مناسبة للتجديد عن طريق تشكل الأعضاء المباشر من أجزاء الأوراق من نموات مكاثرة مخبرياً.
–    التحوير الوراثي لأجزاء الورقة بوساطة بكتريا التدرن التاجي الحاملة للمورثة g2ps1 بالزراعة المشتركة ثم التجديد من أجزاء الأوراق بوجود عامل الانتخابPPT لمقاومة مبيد الأعشاب غلوفوسينات أمونيوم.
–    إكثار الأجزاء النباتية المحورة بوجود عامل الانتخاب PPT
–    إثبات التحوير الوراثي باستخدام تقنية التفاعل السلسلي للبوليميراز للتأكد من وجود مورثة الانتخاب والمورثة g2ps1 .
–    تجذير النباتات المحورة وأقلمتها.
تم إجراء العديد من تجارب التحوير الوراثي للصنف والأصل المدروسين بالمورثة المعنية الموجودة على البلازميد Pgreen II- 35S-g2ps1 من أجل تقييم قدرتها على مقاومة الأمراض الفطرية.
استخدمت الأوراق الخضراء الفتية للتحوير حيث تم الحصول على النباتات المحورة على الوسط الذي احتوى علىTDZ + 0.2 mg/l NAA  2 mg/l أو MS+ 5 mg/l BAP
بوجود عامل الانتخاب  PPT بتركيز  5-3مغ/ل .
تم إكثار النموات المتجددة بوجود عامل الانتخاب بتركيز  5-3مغ/ل للحصول على مادة نباتية كافية لاختبارات التأكد من التحوير الوراثي.
تم الحصول على ستة كلونات مهندسة وراثياً من الصنف  ‘Golden Delicious’ وكلون واحد من الأصل’MM111′ .
وتم إثبات التحوير الوراثي بواسطة الـ PCR  واستخدام مرئسات خاصة للكشف عن المورثة bar  والمورثة g2ps1، وبلغت كفاءة التحوير الوراثي 0.4 % و0.1% للصنف ‘Golden Delicious’  والأصل ‘MM111’ على التوالي. وقد أعطيت الكلونات المهندسة وراثياً الرموز التالية
MM111-T5 GD-T27, GD-T59, GD-T87, GD-T97, GD-T99, GD-T101,
من جهة أخرى، لم يتم الحصول على أية متجددات من النباتات الشاهد غير المحورة على الأوساط التي احتوت على عامل الانتخاب PPT.
تم إكثار النموات المهندسة وراثياً على الوسط المغذي المحتوي على :
MS+B5 vitamins + 1g/l MES +1mg/l  BAP+ 0.3 mg/l IBA+ 0.2 mg/l GA3+30 g/l sugar + 6 g/l Agar.
بوجود عامل الانتخاب PPT  بتركيز 5-3 مغ/ل  ثم إعادة الإكثار كل أربعة أسابيع  على الوسط نفسه.
تم تجذير النموات بطول 3-2  سم على الوسط . ½ MS + 1 mg/l IBA
تمت تقسية النباتات المهندسة وراثياً بنجاح وحفظت في البيت الزجاجي لتقييم أدائها لاحقاً من حيث تحملها للأمراض الفطرية وخاصة جرب التفاح والبياض الدقيقي.