الطالب : يوسف أبو أحمد الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية – إدارة وقاية النبات
المدرسة الوطنية العليا للزراعة في مونبليية – فرنسا
(École nationale supérieure agronomique de Montpellier (ENSAM
2006
الملخص
ينتمي فيروس الورقة الصفراء في قصب السكر Sugarcan yellow leaf virus (SCYLV) إلى الجنس Polerovirus وإلى عائلة فيروسات الاصفرار Luteoviridae ، يعد هذا الفيروس العامل المسبب لمرض الورقة الصفراء في قصب السكر.
في مرحلة أولى من العمل تم تحديد أربع طرز وراثية مختلفة للفيروس SCYLV من خلال التحليل الوراثي المجرى على سلاسل النوكليوتيدات للحمض النووي الفيروسي لـ 43 عزلة فيروسية من جزيرة غينيون في المحيط الهندي و 17 عزلة من مناطق جغرافية مختلفة من العالم إضافة إلى 11 عزلة من بنك المعلومات الوراثية (GenBank). تم الحصول على هذه السلاسل عن طريق الاختبار المتسلسل لأنزيم البلمرة بعد النسخ العكسي (RT-PCR) لأربع قطع من الجينوم الفيروسي (A, B, C, D) تمثل بمجموعها 72% منه, واستنساخ الأجزاء المبلمرة باختبار (Cloning) ومن ثم الحصول على التركيب الوراثي للمجين من خلال الترتيب التسلسلي للقواعد الآزوتية (Sequencing). وبناءا على التحليل الوراثي لكامل المجين الفيروسي لـ 14 عزلة فيروسية من البرازيل والصين وكولومبيا وكوبا وفلوريدا والهند وجزيرة غينيون تم تسمية كل طراز وراثي من الطرز الأربعة بحسب البلد الذي شخص فيه لأول مرة : طراز BRA نسبة للبرازيل, CUB نسبة لكوبا, PER نسبة للبيرو وREU نسبة لجزيرة غينيون. إن نتائج هذه الدراسة تم تثمينها بمقالة علمية نشرت في مجلة ِ Archives of Virology:
Abu Ahmad, Y., Rassaby, L., Royer, Borg, Z., Braithwaite, K.-S., Mirkov, T.-E., Irey, M.-S., Perrier, X., Smith, G.-R., and Rott P. 2006. Yellow leaf of sugarcane is caused by at least three different genotypes of sugarcane yellow leaf virus, one of which predominates on the Island of Reunion. Archives of Virology , 151(7): 1355-1371.
في مرحلة ثانية من البحث وبدءا من الطرز الوراثية الأربعة المحددة في المرحلة الأولى تم تحديد بوادئ (Primers) متخصصة لتمييز وتفريق الطرز عن بعضها بواسطة اختبار الـ RT-PCR حيث تم بنجاح بلمرة جزء واحد من المجين عن طريق كل زوج من البوادئ باستثناء الطرازين الوراثيين BRA و PER القريبين وراثيا إلى حد ما من بعضهما مما دعت الحاجة إلى دمجهما وتسميتهما بالطراز BRA-PER. بعد ذلك تم دراسة التوزع الجغرافي لهذه الطرز الوراثية على مستوى العالم من خلال 245 عزلة فيروسية من 18 بلد منتج لقصب السكر ومتوزعة في مختلف قارات العالم وبينت النتائج أن الطراز الوراثي BRA-PER هو الأكثر إنتشارا في بلدان العالم، في حين أن كل من الطرازين الوراثيين REU و CUB قد تم تحديد انتشارهما فقط في أربع بلدان لكل منهما. من خلال هذه الدراسة تبين تواجد كافة الطرز الوراثية للفيروس SCYLV في جزيرة جوادلوب يظهر بوضوح كفاءة النقل المحلي للفيروس عن طريق حشرات المن الناقل Melanaphis sacchari. من جانب آخر فإن وجود الطراز الوراثي BRA-PER بشكل أساسي وشبه كلي في البرازيل وكذلك الطراز الوراثي REU في جزيرة غينيون يسمح لنا بافتراض وجود تفاعلات قوية وهامة بين الطرز الوراثية وبيئتها وكذلك تطورات متباينة لهذ الفيروس. إن نتائج هذه الدراسة قد تم تثمينها بمقالة علمية نشرت في مجلة Plant Disease:
Abu Ahmad, Y., Royer, M., Daugrois, J.-H., Costet, L., Lett, J-M., Victoria, J.-I., Girard, J.-C., and Rott, P. 2006. Geographical Distribution of Four Sugarcane yellow leaf virus Genotypes. Plant Disease. 90:1156-1160.
على صعيد آخر تم دراسة نسبة التباين الوراثي بين العزلات الفيروسية بعد أن تم دراسة الترتيب الوراثي المتسلسل لكامل المجين لـ 14 عزلة فيروسية والتي أظهرت نسبة التباين المرتفعة لكافة العزلات الفيروسية المنتمية وراثيا إلى الطراز الوراثي CUB (عزلتان من كولومبيا: COL-YL1a, COL-YL2b, واثنتان من كوبا : CUB-YL1a, CUB-YL2b) مقارنة مع العزلات الأخرى العائدة للطرز الأخرى المذكورة أعلاه نسبة تباين (Diversity) أعلى من 20 % خاصة في كوادر القراءة المفتوحة (Open reading Frame : ORF 0, 1, 5) مما قادنا إلى تصنيفهم ضمن نوع فيروسي جديد أقترح مبدئيا بالـ Sugarcane yellow leaf Cuba virus (SCYLCV) ريثما يتم الحصول على موافقة اللجنة الدولية لتصنيف الفيروسات (ICTV).
كما أجريت دراسة مفصلة ومعمقة حول تطور مجين الفيروس من خلال التحليل الوراثي لشجرة النسب (Phylogenetic Tree) والدراسات الإحصائية المتخصصة والمتعمقة باستخدام البرامج (RDP) Recombination Detection Program لكشف وجود ظاهرة تأشيب الـ RNA (Recombination) بين مجينات الطرز المختلفة وكذلك تم استخدام برنامج (PAML) Phyogenetic Analysis Maximum of Liklihoods وبرنامجSNAP) ) لتحديد الرامزات (Codons) أو الأحماض الامينية الواقعة تحت ضغط الإنتخاب الايجابي وقياس الأوميغا (ω= dN/dS) : نسبة الإبدالات الغير مرادفة إلى الإبدالات المرادفة للقواعد الآزوتية لمجين الفيروس) . حيث أظهرت هذه الدراسة بجلاء وجود تبادلات وتأشيبات بين مجينات الطرز الوراثية ووجود بعض حوادث الطفرات من حذف أو إضافة أو استبدال لحمض أميني, بالإضافة إلى الكشف عن الضغط الانتخابي الإيجابي المطبق على كوادر القراءة المفتوحةORFs وعلى بعض الرامزاتcodons المنتخبة ايجابيا وذلك بدراسة التباين في نسبة التبدل المرادف (synonym) والغير مرادف (non-synonym) أوميغا ω = في سلسلة المجين للفيروس SCYLV إذ تبين من خلال هذه الدراسة أن قيمة أوميغا ω > 1 (2 – 14 في كوادر القراءة المفتوحة ORFs 0, (1, 2, 5, وأوميغا ω<1 في الكوادر ORFs 3,4 (المسؤولين عن الغلاف البروتيني وبروتين الحركة والانتقال لدى الفيروس). تم تحديد عشرين رامز على الأقل خاضع للضغط الانتخابي الايجابي (Codon under positive selection)، وبمقارنة نسب تطور الطرز الوراثية عن طريق الساعة الجزيئية (Molecular Clock) تبين أن كادر القراءة المفتوحة ORF1 في الطراز الوراثي PER يتطور بسرعة أكبر بخمس مرات من ذلك الموجود لدى الطرز الأخرى. من جانبا آخر فإنه بالنسبة إلى كادري القراءة المفتوحة ORFs 2 ,5 في الطراز الوراثي BRA فإنها تتطور بـ 2 إلى 3 مرات أسرع من تلك الموجودة لدى الطرز الأخرى. إن مجمل هذه النتائج يمكن تفسيرها بتأقلم هام للفيروس مع نبات قصب السكر خلال الزمن لمختلف الأصناف والأنواع لهذا النبات العائل وكذلك الظروف البيئية المحيطة به. إن نتائج هذه الدراسة قيد الإعداد لنشرها في مجلة Molecular Biology and Evolution.
Abu Ahmad,Y., Gayral, P., Moury, B., Rott, P. and Royer, M. Sequence analysis of Sugarcane yellow leaf virus isolates reveals evidence of a new virus species and evolutionary events. Molecular Biology and Evolution.
في مرحلة ثالثة من العمل تم تحديد وجود العديد من السلالات الفيروسية لـ SCYLV مختلفة في قدرتها الإمراضية (Pathogencity) لقصب السكر من خلال طريقتين:
أولاً: الإعداء الاصطناعي بواسطة حشرات المن Melanaphis sacchari بالطرز الوراثية REU, CUB, BRA-PER لثماني أصناف مختلفة من قصب السكر متباينة في درجة مقاومتها للفيروس في موقعين جغرافيين مختلفين (جزيرة غينيون في المحيط الهندي وجزيرة جوادلوب في البحر الكاريبي); هذه الأصناف تم إكثارها في مونبلييه بفرنسا عن طريق الإكثار الخضري الدقيق ضمن أنابيب إختبار والتي نقلت بدورها إلى الموقعين المذكورين وأعديت إصطناعيا بالطرز الوراثية ( BRA-PER, CUB, REU في جوادلوب) و (BRA-PER, REU في جزيرة غينيون) عن طريق حشرات المن داخل أنابيب الاختبار (نظرا لان الناقل الحشري غير موجود في أوربا ويعتبر حشرة حجر زراعي في فرنسا). تم نقل هذه النباتات المعداة بالفيروس بعد التخلص من المن- بواسطة مبيد حشري متخصص- إلى مونبللييه بفرنسا بغية تحديد كفاءة عملية النقل الفيروسي لهذه الطرز الوراثية. تم تشخيص الفيروس في النباتات المعداة عن طريق إختبار البصمة النسيجية المناعية TBIA وعن طريق الإختبار المتسلسل لأنزيم البلمرة بعد النسخ العكسي RT-PCR وذلك بعد 5 و6 أشهر من تاريخ النقل الفيروسي. أظهرت النتائج بأن الطرازين الوراثيين BRA-PER و CUB قد تم نقلهما بنجاح إلى الأصناف الثمانية من قصب السكر, بينما الطراز الوراثي REU لم ينتقل أبدآ إلى الصنف المتحمل R570 في جزيرة غينيون ولكن انتقل بشكل جيد في جوادلوب. كما أن الطرازين الوراثيين BRA-PER و CUB قد حفزا النباتات المعداة بهما لتطوير أعراض مرض الورقة الصفراء بينما بالمقابل فان النباتات المعداة بالطراز الوراثي REU قلما شجعت على ظهور الأعراض المرضية, هذه النتائج سمحت وللمرة الأولى بإثبات وجود العديد من السلالات الفيروسية من الـ SCYLV مختلفة في قدرتها المرضية. إن نتائج هذه الدراسة قد تم تثمينها بمقالة علمية نشرت في مجلة Plant Disease :
Abu Ahmad, Y., Costet, L., Daugrois, J.-H., Nibouche, S., Letourmy, P., Girard, J.-C., and Rott, P. 2007. Variation in Infection Capacity and in Virulence Exists Between Genotypes of Sugarcane yellow leaf virus. Plant Disease ; 91:253-259.
ثانيا: من خلال مقارنة سلوك النمو السنوي لصنفين من أصناف قصب السكر (ٌ570, SP71-6163) والمصابة طبيعيا بالطرز الوراثية BRA-PER أو REU في مناطق جغرافية مختلفة (البرازيل, كولومبيا, فلوريدا, كوادلوب, هاواي, موريشيوس, جنوب أفريقيا, جزيرة غينيون) والتي منها تم استقدام العقل المصابة الى مونبلييه بفرنسا واستنباتها في الصوب المحمية والتي فيها أجريت الدراسات المقارنة بين هذين الصنفين المصابين بالطرز الوراثية المختلفة لـ SCYLV. تم استخدام تصميم القاعات العشوائية الكاملة بواقع 10 مكررات لكل نبات مصاب بطراز وراثي معين, وهذه التجربة قد كررت مرة كل سنة لمدة ثلاث سنوات (2003-2005). بعد ثلاثة شهر من نمو النباتات في البيوت المحمية, تم مراقبة كافة النباتات بمعدل مرة كل أسبوع وكذلك دراسة تطور أعراض مرض الورقة الصفراء على سلم درجات إصابة مؤلف من ست درجات (0 – 5). تم دراسة العديد من المتغيرات والثوابت بعد ستة شهر من نمو النباتات:
طول الساق الرئيسية وعدد السلاميات والعقد، النسبة المئوية % لسطح أنابيب الغربالية المصابة بالفيروس في الأوراق المتمايزة من الورقة الأولى حتى الرابعة (F1- F4) في الساق الرئيسية والورقة الأولى F1 في إشطاءة واحدة مختارة باستخدام إختبار البصمة النسيجية المناعية (TBIA), الكثافة الفيروسية في الورقة الأولى F1 وذلك باستخدام اختبار الإدمصاص المناعي المرتبط بالأنزيم (ELISA). إن التحاليل الإحصائية لهذه التجربة قد بينت لنا بأن سلوك الفيروس SCYLV يتباين من نبات لآخر حسب أصله الجغرافي والذي يفترض وجود سلالات فيروسية ذات قدرة إمراضية مختلفة. كما أن الإختلافات بين السلالات الفيروسية ليست دائما ثابتة ولايمكن ملاحظة هذه الإختلافات بشكل دائم من سنة لأخرى لأسباب قد تعود إلى الأثر الهام للظروف البيئية المحيطة بالنباتات. إن نتائج هذه الدراسة قد تم تثمينها بمقالة علمية نشرت في مجلة Plant Pathology:
Abu Ahmad, Y., Girard, J.-C., Fernandez, E., Pauquet, J., Lockhart, B.-E.-L. , Letourmy, P and Rott, P. 2007. Variation in virus populations and growth characteristics of two sugarcane cultivars naturally infected by Sugarcane yellow leaf virus in different geographical locations. Plant pathology ;56:743-754.
____________________________________________________________________
Genetic diversity and variability in pathogenicity of Sugarcane yellow leaf virus, the causal agent of yellow leaf of sugarcane
Abstract
Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) is a Polerovirus of the family Luteoviridae and the causal agent of yellow leaf, an emerging disease of sugarcane. Four genotypes of SCYLV (BRA for Brazil, CUB for Cuba, PER for Peru and REU for Réunion) were identified by phylogenetic analyses of the genome of 14 virus isolates from Brazil, China, Colombia, Cuba, Florida, India and Réunion Island. Specific primers were designed to differentiate these genotypes by RT-PCR, and a unique fragment was amplified from each, with the exception of genotypes BRA and PER which are phylogenetically close and which were named genotype BRA-PER. Genotyping by RT-PCR of 245 virus isolates from 18 sugarcane production areas showed that genotype BRA-PER is widespread in the world. In contrast, genotypes CUB and REU were found in only four locations each. In Guadeloupe, the coexistence of genotypes BRA-PER, CUB and REU revealed local transmission of these three genotypes by the aphid vector Melanaphis sacchari. However, nearly exclusive presence of genotype BRA-PER in Brazil and genotype REU in Réunion Island also suggested the existence of strong interactions between SCYLV genotypes and their environment, and therefore different evolution events within this virus. The high percentage of diversity between genotype CUB isolates and isolates of the other genotypes led us to propose the reclassification of CUB isolates within a new species called Sugarcane yellow leaf Cuba virus (SCYLCV). The evolution history of SCYLV was traced by phylogenetic studies and analysis of evolutionary events in the viral genome (recombinations, deletions, insertions) specific to some isolates, and detection of selective pressures on ORFs and positive selection of codons. The occurrence of several strains of SCYLV was demonstrated by inoculation of eight sugarcane varieties with genotypes BRA-PER, CUB and REU via M. sacchari, as well as comparison of virus populations and growth characteristics of two sugarcane varieties naturally infected by genotypes BRA-PER and REU. The genetic origin of these variations in pathogenicity remains to be elucidated.
Key words: Diversity, evolution, genotype, Luteoviridae, new species, pathogenicity, Polerovirus, RT-PCR, SCYLV, virulence.
Résumé
Le Sugarcane yellow leaf virus (SCYLV) est un Polerovirus de la famille des Luteoviridae et l’agent causal de la feuille jaune, une maladie émergente de la canne à sucre. Quatre génotypes du SCYLV (BRA pour Brésil, CUB pour Cuba, PER pour Pérou et REU pour Réunion) ont été identifiés grâce à l’analyse phylogénétique du génome de 14 isolats viraux originaires du Brésil, de Chine, de Colombie, de Cuba, de Floride, d’Inde et de La Réunion. Des amorces spécifiques ont été dessinées pour différencier par RT-PCR ces génotypes et un fragment unique a été amplifié à partir de chacun d’entre eux, à l’exception des génotypes BRA et PER qui sont assez proches et qui ont été désignés génotype BRA-PER. Le génotypage par RT-PCR de 245 isolats viraux originaires de 18 pays producteurs de canne à sucre a permis de montrer que le génotype BRA-PER est largement répandu dans le monde. En revanche, les génotypes CUB et REU ont été trouvés dans seulement quatre pays chacun. La co-existence des génotypes BRA-PER, CUB et REU en Guadeloupe révèle la transmission locale de ces trois génotypes par le puceron vecteur Melanaphis sacchari. Néanmoins, la présence quasi exclusive du génotype BRA-PER au Brésil et du génotype REU à La Réunion suggère aussi l’existence de fortes interactions entre les génotypes du SCYLV et leur environnement, et donc des évolutions différentes de ce virus. Le pourcentage de diversité élevé des isolats du génotype CUB par rapport aux isolats des autres génotypes nous a conduit à proposer leur reclassement au sein d’une nouvelle espèce, le Sugarcane yellow leaf Cuba virus (SCYLCV). L’histoire évolutive du SCYLV a pu être retracée par des études phylogénétiques, par la mise en évidence de remaniements génomiques (recombinaisons, délétions, insertions) propres à certains isolats, de différentiels de pressions sélectives sur les ORFs et de codons sélectionnés positivement. L’existence de plusieurs souches virales au sein du SCYLV a été démontrée grâce à l’inoculation de huit variétés de canne à sucre avec les génotypes BRA-PER, CUB et REU via M. sacchari, ainsi que la comparaison du comportement de deux variétés de canne à sucre naturellement infectées par les génotypes BRA-PER et REU. L’origine génétique de ces variations de pathogénie reste à être élucidée.
Mots clés : Diversité, évolution, génotype, Luteoviridae, nouvelle espèce, pathogénie, Polerovirus, RT-PCR, SCYLV, virulence.